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紫外分光光度法測定峰膠膠囊中總黃酮的含量
【來源:桂西制藥】【作者:admin】【發布時間:2010-12-16】
實驗部分
1.1 儀器與試藥
   TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);sartorius  BP2111D 電子天平;水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司);autoscience  AS5150A 超聲波清洗器。
   蘆丁對照品(0080-9705):中國藥品生物制品檢定所。其余試劑均為分析純。
1.2 溶液的制備
1.2.1 對照品溶液的制備
   取經120℃干燥至恒重的蘆丁對照品適量,精密稱定,加乙醇制成0.2mg/mL的溶液。
1.2.2 供試品溶液得制備
   取本品0.35g精密稱定,置50.0mL容量瓶中,加乙醇適量,超聲處理(150W,50Hz)45min,取出,放冷,加乙醇至刻度,搖勻,即得。
2 方法與結果
2.1 測定波長的選擇
   據藥典及文獻報道,蜂膠中主要含黃酮類成分,可溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯,故采用甲醇、乙醇、醋酸乙酯、75%乙醇、75%甲醇、60%乙醇作為提取溶劑進行考察。據藥典介紹,蘆丁最大吸收波長在500nm左右,故取各個樣品溶液與蘆丁對照品乙醇溶液,以不加樣品(但需要加顯色劑及NaOH試液)的乙醇溶液為空白,分別于300~600nm波長范圍內進行掃描。結果見表1。
表1 不同提取溶劑的提取結果
提取溶劑
甲醇
乙醇
醋酸乙酯
75%乙醇
75%甲醇
60%乙醇
樣品吸收波長(nm)
378
402
398
501
378
493
蘆丁吸收波長(nm)
503
 
   由表1可見,蘆丁對照品在503nm波長處有最大吸收,樣品(75%乙醇處理)在501nm波長處有最大吸收,考慮到操作誤差及儀器因素,故選擇75%乙醇作為樣品提取溶劑,501nm作為測定波長。
2.2 標準曲線的制備
   精密量取對照品溶液(濃度0.204mg/mL)1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL,置25.0mL容量瓶重,各加甲醇至6mL,加5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻,放置6min,加10%硝酸鋁溶液1mL,搖勻放置6min,加氫氧化鈉試液10mL,搖勻,加乙醇至刻度,搖勻,放置15min,按紫外分光光度法(《中國藥典》2000年版一部附錄VA),在波長501nm處測定吸收度,以吸收度與其對應的濃度計算回歸方程。回歸方程C=2.4445×10-4+8.495×10-2A;r=0.9999,濃度在0.00816~0.04896mg/mL范圍內,與吸收度呈良好線性關系。
2.3  加樣回收率試驗
   精密稱取已知含量的供試品(含量5.74%),精密加入對照品適量(三種不同水平,各兩份),按正文總黃酮含量測定方法進行含量測定,計算回收率,其中吸收度已扣除樣品空白吸收,結果見表2。
表2  回收率測定結果
NO.
吸收度
樣品取樣量(g)
樣品中總黃酮含量(mg)
對照品加入量(mg)
實測總黃酮含量(mg)
回收率(%)
平均回收率(%)
RSD
(%)
1
0.033
0.0204
1.170
0.816
1.952
95.8
99.0
2.28
2
0.033
0.0202
1.158
0.816
1.952
97.3
3
0.034
0.0171
0.984
1.020
2.005
100.1
4
0.035
0.0178
1.019
1.020
2.059
102.0
5
0.034
0.0139
0.799
1.224
2.005
98.5
6
0.034
0.0135
0.776
1.224
2.005
100.4
2.4 精密度試驗
   取同一批蜂膠膠囊樣品,按供試品溶液的制備與測定法制備供試品溶液,重復進樣測定5次,吸收度(A)的相對標準偏差RSD為1.40%。
2.5 穩定性試驗
   供試品溶液于制樣后不同時間進樣測定,結果見表3。實驗所得RSD為1.62%,說明供試品溶液在制樣后30min內測定穩定。
表3  供試品溶液的穩定性考察
測定時間(min)
15
20
25
30
RSD(%)
吸收度(A)
0.521
0.517
0.506
0.504
1.62
2.6 樣品測定
   取蜂膠膠囊樣品6批,按供試品溶液制備,精密量取續慮液5mL至25.0mL的量瓶中,加75%乙醇至10mL,照標準曲線制備項下的方法,自“加5%亞硝酸鈉溶液1mL”起,依法操作,另量取乙醇10mL至25.0mL的容量瓶中,照標準曲線制備項下的方法,自“加5%亞硝酸鈉溶液1mL”起,依法操作;另精密量取供試品續慮液5mL至25.0mL容量瓶中,加氫氧化鈉試液10mL,搖勻,加乙醇至刻度,搖勻,放置15min,作為樣品空白,在波長501nm處,以試劑空白液校正基線,測定供試品液與樣品空白液吸收度,用供試品液吸收度減去樣品空白液吸收度的值代入回歸方程計算供試品溶液中總黃酮的量。結果見表4。
表4 蜂膠膠囊含量測定結果
樣品編號
測定結果(mg/粒)
平均
1
2
01
24.9
22.0
23.5
02
23.4
21.2
22.3
03
20.6
22.1
21.4
04
20.2
20.1
20.2
05
21.2
21.4
21.3
06
19.9
20.0
20.0
3討論
3.1 提取方法的考察
取樣品5份,按不同方法進行處理,結果見表5。
表5  不同提取方法的提取結果
提取方法
吸光度(A)
總黃酮含量(%)
超聲30min
0.343
5.34
超聲45 min
0.372
5.76
超聲60 min
0.370
5.73
冷浸60 min
0.300
4.66
回流45 min
0.354
5.54
由表5可見,超聲45 min,所得的總黃酮含量較其它方法高,故選用超聲45 min作為提取方法。
3.2 穩定性考察
    穩定性試驗中,每隔5 min測定了樣品的吸收度,結果35min時其吸收度降為0.483,RSD為2.93%,且溶液顏色已開始變淺,考慮到對測定結果準確性的影響,故應在顯色后30min內測定。
 
 

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